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                    漆酶酶活的快速測定技術
                      發布時間:2020-02-12    供稿部門:

                      項目概況 

                      酶活是酶和酶制劑的挖掘、創制、研究、生產、分離純化及應用的一個必不可少的參數。分光光度法是最常用的酶活測定技術,目前利用分光光度法測定酶活只測定反應開始及結束時的底物或產物濃度,無法判斷在反應過程中底物濃度是否一直處于使酶保持初始催化反應速率的濃度范圍之內,測定的結果實際上是兩個測定時間點之間的平均催化速率,影響到酶活檢測結果的準確性、重現性和可比性。由于該方法酶的催化反應過程與吸光度的檢測在時間和空間上是相互分離的,導致操作復雜,容易出現誤差。 

                      酶催化的反應溫度和反應時長的計量是酶活檢測準確與否的重要影響因素。現有的酶活測定方法,酶催化反應體系在反應起始階段的試劑混和與溫度控制過程,在終止酶催化反應的階段均存在較大的系統誤差和偶然誤差。為了減少上述誤差,往往通過較高濃度的底物和較長的酶催化反應時長(通常控制在1060 min),來減少計量誤差的影響。而過長的檢測時長進一步限制了將其應用于高通量檢測和在線檢測。 

                      本成果以漆酶為研究對象,設計了自動化恒溫反應分光光度系統,建立了基于恒溫催化反應過程中實時測定吸光度的酶活快速測定方法。 

                      應用前景 

                      本成果簡化了操作,提高了計量精度,減少了誤差,大幅度縮短了檢測時長,測定酶的初始催化反應速率,及時獲得更加準確的重現性更好的檢測結果。 

                      將本成果擴展到其他酶的酶活分光光度法檢測,進一步通過進樣、混勻、測定及清洗操作的自動化以及多個樣液或參數的同時測定,可以開發研制酶活的自動測定儀、酶活的高通量檢測儀及酶活的在線檢測儀。 

                      技術特點 

                      本成果使酶的恒溫催化反應與吸光度的檢測在同一時空進行,實現了檢測過程中酶催化反應溫度的精確控制及催化反應時長的精確計量,大幅度降低了因計量而引起的誤差。由于可以在酶恒溫催化反應的同時實時監測產物(或底物)濃度及反應速率的變化,一方面,可以避免反應過程中因底物的消耗而引起測定結果的誤差,確保通過初始催化反應速率計算酶活,測定結果準確。另一方面,由于初始催化反應速率是酶的重要特征,因而更便于不同酶及其制劑活力的比較。在此基礎上,不僅顯著縮短了檢測所需的時間(本成果對漆酶酶活的檢測時長最快只需2 秒),可滿足高通量檢測對檢測時長的要求,而且大幅度降低了底物和待測酶液的濃度,節省試劑成本。由于本成果不需要終止催化反應,大幅度簡化了操作程序,進一步縮短了檢測全過程消耗的總時間。 

                      申請和授權專利:基于恒溫催化反應過程中實時測定吸光度的酶活測定方法,CN 2019 1 1189740.3;恒溫反應分光光度測定系統及其檢測方法,CN 2017 1 1277818.8;恒溫反應分光光度測定系統,ZL 2017 2 1688285.8 

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